En un artículo anterior, presenté una breve descripción general de los complejos mecanismos moleculares que rigen la replicación del ADN. Ahora, me centraré específicamente en la enzima de replicación, la ADN polimerasa.
La ADN polimerasa es la enzima responsable de sintetizar nuevas cadenas de ADN, complementarias a la secuencia de la cadena plantilla. La ADN polimerasa unidireccional avanza a lo largo de la cadena plantilla en dirección 3′-5′ (se lee, de la base 3 prima a 5 prima), ya que requiere un grupo 3′-OH preexistente para la adición de nucleótidos. En consecuencia, la cadena hija se sintetiza en dirección 5′-3′ (opuesta a la dirección de movimiento de la polimerasa, ya que las dos cadenas tienen una orientación antiparalela).
Existen seis familias diferentes de ADN polimerasas: A, B, C, D, X e Y (Rothwell y Waksman, 2005). Estas familias difieren entre sí en su diseño, ya que están especializadas para diversos propósitos. Por ejemplo, la ADN polimerasa I, presente en E. coli, pertenece a la familia A de polimerasas. Además de su función en la finalización de la replicación del ADN y la eliminación de los cebadores de ARN, la ADN polimerasa I contiene un dominio de exonucleasa 5′ a 3′, además del dominio de exonucleasa 3′ a 5′, que le permite eliminar nucleótidos tanto delante como detrás de ella (más adelante se hablará más sobre la corrección de errores mediante dominios de exonucleasa) (Ishino et al., 1995). Las polimerasas de las familias B, C y D son conocidas por su alta fidelidad (debido a su exonucleasa de corrección de errores 3′ a 5′ intrínseca) y se encuentran en eucariotas, bacterias y arqueas, respectivamente. La familia X (p. ej., las polimerasas eucariotas pol (beta), Pol (lambda), Pol (mu), Pol (sigma)) participa en la reparación del ADN, rellenando los huecos creados durante el proceso (Yamtich y Sweasy, 2010). Mientras que la mayoría de las polimerasas no pueden replicarse tras lesiones voluminosas en el ADN dañado, la familia Y sí puede replicarse tras ellas (Washington et al., 2010).
Las ADN polimerasas generalmente comparten una estructura común, con subdominios en los dedos, el pulgar y la palma que conforman el dominio de la polimerasa. El diagrama a continuación, extraído de Beard y Wilson (2003), muestra la estructura de la ADN polimerasa T7, revelando sus dos dominios: un dominio de polimerasa (coloreado) y un dominio de exonucleasa de corrección (gris). El dominio de la polimerasa se compone de tres subdominios: dedos, pulgar y palma. El dominio de los dedos posiciona los nucleósidos trifosfato entrantes en relación con la cadena molde. Se cree que el dominio del pulgar participa en la procesividad, posicionamiento y translocación del ADN, manteniendo en su lugar el dúplex de ADN en elongación. La lámina β que compone el dominio de la palma es donde se encuentra el sitio activo de la enzima, que cataliza la transferencia de grupos fosforilo en la reacción de transferencia de fosforilo.
¿Cómo añade la ADN polimerasa nuevos nucleótidos a la hebra en elongación? El sitio activo de la polimerasa, ubicado en la cadena β que conforma el subdominio palm, cataliza una reacción de transferencia de fosforilo. Forma un enlace fosfodiéster al unir el grupo hidroxilo 3′ del extremo de la hebra molde al grupo fosforilo 5′ del nucleótido. El primer paso del proceso es un ataque nucleofílico al fosfato 5′ del nucleósido trifosfato entrante por el OH 3′ de la cadena en crecimiento. Esta reacción libera pirofosfato (PPi). Dentro del sitio activo, hay dos residuos de aspartato conservados. Los iones de magnesio en los grupos carboxilato de estos aspartatos son cruciales para la reacción. Estos grupos carboxilato coordinan los iones de magnesio y facilitan su participación en la catálisis manteniéndolos en la orientación correcta. Uno de los dos iones de magnesio activa el grupo OH 3′ del nucleótido terminal. La otra es responsable de estabilizar la carga negativa que se desarrolla en el oxígeno saliente del nucleósido trifosfato entrante. Las cadenas laterales de una hélice alfa en el dominio de dedo interactúan con el trifosfato entrante para estabilizarlo también. La hidrólisis del pirofosfato liberado en este proceso genera la energía necesaria para impulsar la reacción. Para una revisión más detallada de los mecanismos involucrados, remito a los lectores a Rothwell y Waksman (2005).
El proceso mediante el cual la ADN polimerasa selecciona el nucleótido correcto es menos conocido. Para una discusión más detallada, remito a los lectores a Markiewicz et al. (2012).
Como mencioné en mi publicación anterior, se cree que la velocidad a la que la ADN polimerasa replica el ADN es de unos impresionantes 749 nucleótidos por segundo (McCarthy et al., 1976) y que la tasa de error de las polimerasas precisas se sitúa entre 10-7 y 10-8, según estudios de replicación de ADN de E. coli y bacteriófagos (Schaaper, 1993). Esta extraordinariamente alta fidelidad se logra gracias a una notable función de corrección de errores integrada en la enzima, que verifica la identidad de los nucleótidos tanto durante como después de la polimerización.
El primer nivel de monitorización se produce porque, al aparearse las bases con la cadena complementaria (A con T o C con G), los nucleótidos correctos encajan con precisión en el sitio activo, mientras que los nucleótidos con apareamiento incorrecto presentan una geometría diferente y no encajan con tanta precisión en el sitio activo (Johnson y Beese, 2004).
A veces, sin embargo, este primer nivel de monitorización no logra evitar la entrada de un nucleótido incorrecto. Afortunadamente, también existe un segundo nivel de corrección. Además del sitio activo de la polimerasa, la ADN polimerasa posee un sitio activo de exonucleasa 3′ a 5′, que puede escindir un nucleótido incorrecto del extremo 3′ de la cadena de ADN en crecimiento antes de la síntesis del nucleótido subsiguiente. Cuando se incorpora por error un nucleótido incorrecto, la velocidad de actividad de la polimerasa se retrasa significativamente.
Los estudios han demostrado que la presencia de un desajuste puede reducir la eficiencia de la polimerasa en la elongación posterior entre cien y un millón de veces (Kunkel y Bebenek, 2000; Goodman et al., 1993; Echols y Goodman, 1991). Esto proporciona tiempo suficiente para la desnaturalización espontánea del ADN en el extremo 3′, facilitando así la transferencia del extremo 3′ con el nucleótido desapareado al sitio de exonucleasa 3′ de la polimerasa, que cataliza la eliminación de múltiples nucleótidos del extremo 3′ de la cadena de ADN. Posteriormente, el extremo 3′ se reposiciona en el sitio activo de la polimerasa, y la polimerasa puede entonces continuar su actividad de síntesis de ADN en la dirección 5′-3′.
La siguiente animación muestra este notable proceso en acción:
Sin embargo, cabe señalar que no todas las ADN polimerasas poseen una exonucleasa correctora intrínseca. Las polimerasas pertenecientes a la familia Y, por ejemplo, tienden a ser significativamente menos precisas (Friedberg et al., 2001). Los miembros de esta familia «carecen de una exonucleasa correctora intrínseca, presentan baja procesividad, replican el ADN con baja fidelidad y se cree que asisten a los complejos de replicación bloqueados en las lesiones del ADN» (Beard et al., 2002).
La ADN polimerasa es solo uno de los numerosos complejos proteicos que desempeñan un papel importante en la replicación del ADN. Una visión general de la maquinaria implicada en el proceso de replicación es más que suficiente para justificar una inferencia de diseño. A medida que profundizamos y examinamos los subcomponentes individuales que conforman la maquinaria de replicación del ADN de la célula, la defensa del diseño se vuelve cada vez más difícil de ignorar. En artículos posteriores, continuaré esta exploración de los intrincados procesos moleculares que subyacen a la biosíntesis del ADN.
Artículo publicado originalmente en inglés por Jonathan McLatchie Ph.D. en Science & Culture Today
